Entwicklung von Referenzgenen für RT

Dec 26, 2023

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 12296 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Jatropha curcas ist eine Ölsaatenpflanze mit Bioraffinerie-Anwendungen. Während der nach der Ölextraktion entstehende Kuchen Potenzial als Proteinquelle für Tierfutter bietet, ist eine Inaktivierung der im Material vorhandenen giftigen Phorbolester erforderlich. Pleurotus pulmonarius ist ein Entgiftungsmittel für Jatropha-Kuchen mit zusätzlichem Potenzial als Tierfutter, Speisepilz und zur Enzymproduktion. Für die Charakterisierung von Pilzgenen, die am Phorbolesterabbau beteiligt sind, sowie für andere industrielle Anwendungen ist die Reverse Transkriptions-quantitative PCR (RT-qPCR) ein Werkzeug, das eine genaue Quantifizierung der Genexpression ermöglicht. Für eine zuverlässige Analyse sind hierfür Referenzgene zur Normalisierung der mRNA-Spiegel erforderlich, die unter den für Zielgene verwendeten Bedingungen validiert wurden. Die Stabilität der potenziellen Referenzgene β-TUB, ACTIN, GAPDH, PHOS, EF1α, TRPHO, LAC, MNP3, MYP und VP wurde nach dem Wachstum von P. pulmonarius auf toxischem, nicht toxischem Jatropha-Kuchen bzw. einer kombinierten Behandlung bewertet. NormFinder- und geNorm-Algorithmen zur Analyse der Expressionsstabilität identifizierten PHOS, EF1α und MNP3 als geeignet für die Normalisierung der Genexpression. Referenzgenkombinationen mit unterschiedlicher Rangfolge wurden nach Normalisierung der relativen Expression des CHU_2040-Gens verglichen, das für ein Esteraseenzym kodiert, das möglicherweise am Phorbolesterabbau beteiligt ist. Die Referenzgene für P. pulmonarius werden die Aufklärung der Mechanismen erleichtern, die an der Entgiftung von Phorbolestern beteiligt sind, sowie die Analyse von Zielgenen für die Anwendung in Bioraffineriemodellen.

Das aktuelle globale Bestreben, die negativen Auswirkungen der Industrie auf die Umwelt zu reduzieren, hat zur Entwicklung des Bioökonomie-Konzepts geführt, bei dem Wirtschaftssektoren auf Nachhaltigkeit ausgerichtet werden und erneuerbare biologische Ressourcen für die Lebensmittel-, Material- und Energieproduktion genutzt werden. Die Agrarindustrie durchläuft einen Wandel hinsichtlich erneuerbarer Rohstoffe, kohlenstoffarmer Produktion und Landnutzungsoptimierung im Rahmen integrativer Modelle wie Bioraffinerien. In diesem Zusammenhang wird Jatropha curcas L., eine Ölsaatenpflanze mit potenziellen industriellen und landwirtschaftlichen Anwendungen, vor allem als potenziell nachhaltige Biokraftstoffpflanze anerkannt1,2,3. Allerdings bestehen Schwierigkeiten bei der Wertschöpfung des Nebenprodukts Jatropha-Kuchen, bei dem es sich um einen lignozellulosehaltigen Rückstand handelt, der reich an Proteinen, Stickstoff, Phosphor, Kalium und Kohlenstoff ist. Die Verwendung dieser Rückstände in Tierfutter ist derzeit aufgrund des Vorhandenseins toxischer und thermostabiler ernährungshemmender Faktoren wie Phorbolester-Diterpene4,5,6 begrenzt.

Terpene sind chemische Verbindungen, die aus dem sekundären Pflanzenstoffwechsel stammen und eine grundlegende Rolle bei der Pflanzenentwicklung, ökologischen Interaktionen und Abwehrreaktionen gegen Schädlinge und Krankheitserreger spielen7,8. Diese chemischen Verbindungen werden zwar häufig in industriellen Prozessen wie der Herstellung von Kosmetika, Pharmazeutika, Arzneimitteln und Insektiziden7,9,10 verwendet, gehören aber auch zu den Hauptschadstoffen, die bei der industriellen Zellstoff- und Papierproduktion anfallen11. Vor diesem Hintergrund ist die Bioprospektion von Mikroorganismen, die solche Substanzen und ihre Derivate abbauen können, von grundlegender Bedeutung für die Bioremediation. Die biologische Entgiftung von Diterpenphorbolestern in Jatropha-Kuchen bietet Potenzial für die nachträgliche Verwendung der Rückstände als Düngemittel oder Tierfutterzusatz. Geeignete Mikroorganismen können nicht nur den Abbau vorhandener toxischer Verbindungen ermöglichen, sondern möglicherweise auch gleichzeitig den Nährwert erhöhen oder andere wertschöpfende Nebenprodukte wie Enzyme, bioaktive Verbindungen und/oder Speisepilze erzeugen. Die Gene und Stoffwechselwege, die dem biologischen Abbaumechanismus von Phorbolester im Kuchen zugrunde liegen, der nach der Ölextraktion aus J. curcas entsteht, sind derzeit wenig erforscht. Es wurde jedoch gezeigt, dass spezifisches mikrobielles Wachstum zur Sekretion extrazellulärer Enzyme wie Esterasen, Lipasen und Proteasen führen kann, die beim Abbau des toxischen Diterpens3,12 eine Rolle spielen.

Pilzarten der Gattung Pleurotus werden heute in der Bioökonomie, in der grünen Chemie und bei der Herstellung essbarer Proteinersatzstoffe eingesetzt. Diese kultivierten Pilze, bekannt als Austernpilze, gehören zu den weltweit am häufigsten angebauten Pilzen13. Der Produktionserfolg ist vor allem auf die Effizienz der Fruchtbildung und des Anbaus auf verschiedenen Substraten zurückzuführen14. Es gibt zahlreiche biotechnologische Produkte mit Anwendungen in der Bioremediation, Mycoremediation, Biobehandlung und Anreicherung von lignozellulosehaltigen Abfällen, der biologischen Kontrolle, der Entwicklung katalytischer Produkte und der Produktion von Polysacchariden wie Ergosterol15,16,17,18. Unter den Austernpilzen ist Pleurotus pulmonarius effizient beim Abbau von Phorbolestern in Jatropha-Kuchen, mit zusätzlichem Potenzial für die Anwendung in Bioraffineriemodellen3. Die Identifizierung von Genen in diesem Basidiomyceten-Pilz, die am Abbau von Phorbolestern beteiligt sind, muss noch durchgeführt werden und stellt einen wichtigen Schritt hin zu einem effizienten enzymatischen Abbau und der Lösung von Engpässen im Zusammenhang mit dem biologischen Abbau dar. In diesem Zusammenhang eignen sich Hochdurchsatz-Sequenzierungsansätze zur Analyse des Pilztranskriptoms zur Identifizierung exprimierter Gene und Stoffwechselwege, die während des Abbaus dieser toxischen Verbindung aktiviert werden, sowie zusätzlicher Gene, die die Expression verschiedener Enzyme kodieren und regulieren Industrielle Anwendung3,12.

Zur genauen Quantifizierung und Validierung von Genexpressionsdaten, die aus Hochdurchsatz-Transkriptomsequenzdaten stammen, ist die Reverse Transkriptions-quantitative PCR (RT-qPCR) ein Benchmark-Analysewerkzeug für die Anwendung unter verschiedenen experimentellen Bedingungen19,20,21,22,23,24. Eine robuste Analyse erfordert jedoch die Verwendung eines geeigneten Satzes von Referenzgenen zur Normalisierung der Transkriptexpression, um die Daten hinsichtlich der Variation zwischen den Proben zu korrigieren. Gemäß den Richtlinien zu Mindestinformationen für die Veröffentlichung quantitativer Echtzeit-PCR-Experimente (MIQE)25 ist eine Normalisierung der Expression jedes Zielgens im Verhältnis zu einem Referenzgen erforderlich, um Daten hinsichtlich potenzieller Variationen zwischen Probenreplikaten zu korrigieren, die häufig während der cDNA-Vorbereitung auftreten . Für eine solche Normalisierung sind für jeden Organismus spezifische Referenzgene erforderlich, die mikrobielle Wachstumsbedingungen, Gewebetyp und Expressionszeitpunkte berücksichtigen25,26,27. Ein geeignetes Referenzgen zur Normalisierung der Genexpression sollte unabhängig von Probe, Zustand, Behandlung, Zell- und Gewebetyp eine konstante Expression aufweisen28,29. Um die stabilsten normalisierenden Gene zu bestimmen, werden im Allgemeinen verschiedene Algorithmen mit unterschiedlichen statistischen Methoden angewendet, die die besten Sätze stabiler Gene ermitteln30,31,32.

Die genetische Stabilität von Referenzgenen wurde zuvor bei verschiedenen Arten der Gattung Pleurotus untersucht, darunter Pleurotus ostreatus19,33,34,35; Pleurotus eryngii36 und Pleurotus tuber-regium37. Angesichts des Potenzials von P. pulmonarius sowohl für den Abbau von Phorbolestern als auch für die gleichzeitige Anwendung in Bioraffineriemodellen unter Verwendung von Jatropha-Kuchen als Kohlenstoffquelle ist eine Analyse der Genexpression von Pilzen gerechtfertigt. Für eine genaue zukünftige Analyse der Zielgenexpression sind daher für diese Art Referenzgene für RT-qPCR erforderlich. Diese Studie untersucht die Zuverlässigkeit potenzieller Referenzgene für P. pulmonarius während des Wachstums auf Jatropha-Kuchen in Gegenwart und Abwesenheit toxischer Phorbolester.

Fünfzehn Kandidatengene wurden auf Spezifität und Stabilität als potenzielle Referenzgene für P. pulmonarius getestet, der auf Jatropha-Kuchen in Gegenwart und Abwesenheit von Phorbolestern kultiviert wurde. Primerinformationen für jedes bewertete Gen sind in der Ergänzungstabelle S1 beschrieben. Von den ersten 15 Kandidatengenen zeigten fünf Gene, nämlich PEP, ACTIN2, LAC2, CHS und α-TUB, keine spezifische Amplifikation mittels RT-PCR und wurden daher anschließend nicht mittels RT-qPCR getestet. Für die verbleibenden 10 Gene wurde die Spezifität der Primeramplifikation für einzelne Genloci durch Analyse der Schmelzkurven bestätigt, wie in der ergänzenden Abbildung S1 gezeigt, wobei für jedes Primerpaar einzelne Peaks erhalten wurden. Die PCR-Amplifikationseffizienzwerte für die Kandidatengene lagen nach Berechnung mit der Software LinRegPCR zwischen 1,956 und 1,85 (Tabelle 1).

Die Variation der Cq-Werte (Zyklusquantifizierung) für die 10 Kandidatengene wurde analysiert und mithilfe einer Box-Plot-Darstellung dargestellt, in der Expressionsintervalle, durchschnittliche Cq-Werte (Mittelwert und Median) und abweichende Ausreißerwerte beobachtet werden können. Die Analyse jedes Gens wurde unter unterschiedlichen Bedingungen durchgeführt, nämlich P. pulmonarius, gezüchtet auf Jatropha-Kuchen mit der Anwesenheit von toxischem Phorbolester (Behandlung T) (Abb. 1A), und P. pulmonarius, gezüchtet auf Jatropha-Kuchen ohne giftigen Phorbolester (Behandlung NT). ) (Abb. 1B) und durch Berücksichtigung von P. pulmonarius unter beiden Bedingungen (als kombinierte Behandlung (C) bezeichnet, die einen Datensatz kombinierter T- und NT-Daten darstellt) (Abb. 1C). In Gegenwart toxischer Phorbolester lagen die Cq-Werte bei allen Kandidaten-Referenzgenen zwischen 16,9 und 29,1. Unter dieser Bedingung wies das ACTIN-Gen die niedrigste Anzahl an Zyklen auf, was auf eine stärkere Expression als die anderen Kandidatengene hinweist, während das Peroxidase (VP)-Gen den höchsten Cq-Wert aufwies, was auf die niedrigste Genexpression hinweist. Die größte Cq-Variation wurde für das Gen VP beobachtet, wobei GAPDH die geringste Cq-Variation aufwies, mit einem Mittelwert und Median ähnlich dem EF1α-Gen. Das LAC-Gen war der einzige Kandidat, der Ausreißer für diese Erkrankung aufwies. Für die NT-Bedingung der Kultivierung von P. pulmonarius auf Jatropha-Kuchen ohne giftige Phorbolester lagen die Cq-Werte zwischen 15,6 und 30,8. Für diese Erkrankung wies das MYP-Gen den höchsten Cq-Wert auf, während der niedrigste Cq-Wert für das ACTIN-Gen beobachtet wurde, wo auch die höchste Cq-Variation beobachtet wurde. Das Gen VP war der einzige Kandidat in dieser Erkrankung, der Ausreißer aufwies, wobei die geringste Cq-Variation für das GAPH-Gen beobachtet wurde. Für die kombinierte Erkrankung zeigten die ACTIN- und VP-Gene die niedrigsten bzw. höchsten Cq-Werte. Beide Gene zeigten jedoch eine große Variation im Cq, wie auch beim MYP-Gen beobachtet. Die geringste Variation von Cq für diese Erkrankung wurde für die Gene GAPDH und EF1α beobachtet.

Boxplot-Darstellung der Variationen der Cq-Werte für die zehn getesteten Kandidatengene zur Stabilisierung der Genexpression von Pleurotus pulmonarius, kultiviert auf toxischem und ungiftigem Jatropha-Kuchen. (A) Giftig, (B) ungiftig, (C) kombiniert.

Die Stabilität der Expressionsstabilität des Kandidaten-Referenzgens für P. pulmonarius, kultiviert auf Jatropha-Kuchen, der T, NT und kombinierte Daten für Behandlungen darstellt, wurde mithilfe der Algorithmen BestKeeper, geNorm und NormFinder bewertet. Die Rangfolge der Expressionsstabilität nach jeder biologischen Behandlung ist in Tabelle 2 zusammengefasst.

Die Analyse mit dem geNorm-Algorithmus ergab Stabilität für die P. pulmonarius-Kandidatengene β-TUB, PHOS, EF-1 und MNP3 unter allen Behandlungsbedingungen, wobei Stabilitätswerte unter der Standardgrenze von 0,5 lagen, was Stabilität darstellt (Abb. 2). Im Gegensatz dazu zeigte das VP-Gen über alle Behandlungen hinweg Werte über 0,5. Für die Gene MYP, TRPHO und GAPDH wurde Stabilität nur während des Pilzwachstums während der Behandlung T beobachtet, wobei Werte von 0,11, 0,12 bzw. 0,472 beobachtet wurden. Die LAC- und ACTIN-Gene zeigten nur während der NT-Behandlung Stabilität mit Werten von 0,116 bzw. 0,394. Eine paarweise Variationsanalyse (V) wurde mit geNorm durchgeführt, um die Mindestanzahl an Genen zu bestimmen, die zur Normalisierung der Genexpression in P. pulmonarius auf J. curcas-Kuchen erforderlich sind. Die in Abb. 3 dargestellten Daten zeigen einen paarweisen Variationswert von V2/3 von V < 0,15 für alle Pilzwachstumsbedingungen, was darauf hindeutet, dass zwei Referenzgene für die Normalisierung der Genexpression über die Behandlungen hinweg ausreichen.

Vom GeNorm-Algorithmus abgeleitete Daten zur Stabilität von Kandidaten-Referenzgenen zur Normalisierung der Genexpression mittels qPCR in Pleurotus pulmonarius unter den drei analysierten Bedingungen: toxisch, ungiftig und kombiniert. Werte von M unter einem Grenzwert von 0,5 weisen auf eine hohe Stabilitätsrate hin.

GeNormV-basierte Bestimmung der optimalen Anzahl von Referenzgenen für eine genaue RT-qPCR-Normalisierung der Zielgenexpression. Für alle Datenwerte unter einem Grenzwert von 0,15 tragen zusätzliche Referenzgene nicht wesentlich zur Normalisierung der Genexpressionsdaten bei.

Die Rankingdaten zur Genstabilität nach der Analyse mit dem Algorithmus NormFinder sind in Abb. 4 dargestellt. In Übereinstimmung mit den mit geNorm erhaltenen Rankingdaten zeigten die PHOS- und EF1α-Gene unter allen Behandlungsbedingungen die größte Stabilität. Im Fall des MNP3-Gens zeigte die Analyse mit NormFinder eine hohe Stabilität der Expression in P. pulmonarius unter Kultivierungsbedingungen auf toxischem Jatropha-Kuchen und unter Berücksichtigung der Daten für die kombinierten Bedingungen. Ebenfalls in Übereinstimmung mit den geNorm-Daten zeigten die Gene TRPHO und MYP während des Wachstums nur unter toxischen Bedingungen eine größere Stabilität, während die Gene β-TUB, ACTIN und LAC, die ebenfalls nur unter toxischen Bedingungen Stabilität zeigten, ein abweichendes NormFinder-Stabilitätsprofil zeigten aus geNorm-Ranking-Daten.

Vom NormFinder-Algorithmus abgeleitete Daten zur Stabilität von Kandidaten-Referenzgenen zur Normalisierung der Genexpression mittels qPCR in Pleurotus pulmonarius unter den drei analysierten Bedingungen: toxisch, ungiftig und kombiniert. Werte von M unter einem Grenzwert von 0,5 weisen auf eine hohe Stabilitätsrate hin.

Die Analyse mit dem Programm BestKeeper ergab, dass nur das GAPDH-Gen unter den drei verschiedenen Bedingungen einen Standardabweichungswert von weniger als 1 für P. pulmonarius aufwies, und dass das EF1α-Gen während der NT-Behandlung einen Wert von 0,94 für P. pulmonarius aufwies (Tabelle 2). Die Ergebnisse unterschieden sich im Allgemeinen von denen, die mit den Algorithmen geNorm und NormFinder erzielt wurden, mit Ausnahme des Gens EF1α, das bei allen drei verwendeten Algorithmen Stabilität zeigte.

Um die Rangfolge der Referenzgen zu validieren, wurde die relative Expression des CHU_2040-Gens gegenüber verschiedenen Referenzgenkombinationen normalisiert. Dieses Gen kodiert für ein Esteraseenzym, das möglicherweise am Phorbolesterabbau beteiligt ist. Die Analyse der RNA-seq-Daten von P. pulmonarius auf J. curcas (unveröffentlicht) hat ergeben, dass das CHU_2040-Gen über 3, 7 und 11 Tage der Kultivierung auf toxischem Jatropha-Kuchen im Vergleich zur Kultivierung auf ungiftigem Kuchen eine unterschiedliche Expression aufweist . Für Normalisierungstests unter Verwendung des CHU_2040-Gens wurden verschiedene Kombinationen von Genen verglichen, die als am stabilsten (PHOS und EF1α; EF1α und MNP3) und als am wenigsten stabil (LAC und VP) eingestuft wurden. Abbildung 5 zeigt, dass die Normalisierung der relativen Expression des CHU_2040-Gens unter Verwendung der beiden stabilsten Genpaarkombinationen über den untersuchten Zeitverlauf ein ähnlich positives Expressionsprofil des Gens ergab, allerdings mit Variationen in den Expressionsniveaus und mit RT-qPCR-Daten, die dies unterstützen Silico-Daten. Im Gegensatz dazu führte die Normalisierung mit den beiden am wenigsten stabilen Genkandidaten über den Zeitverlauf zu unterschiedlichen Genexpressionsprofilen des CHU_2040-Gens mit größerer Standardabweichung.

Relative Expressionsniveaus des Esterase-Gens CHU_2040 in Pleurotus pulmonarius unter Verwendung der stabilsten (EF1α und PHOS; EF1α und MNP3) und der am wenigsten (LAC und VP) stabilen Referenzgenpaare. RT-qPCR wurde mit drei biologischen Replikaten unter Berücksichtigung der kombinierten Bedingung C (Datensätze für P. pulmonarius, kultiviert auf toxischem und nicht toxischem Jatropha-Kuchen) durchgeführt. (A) EF1α und PHOS; (B) EF1α und MNP3; (C) LAC und VP.

Angesichts der möglichen Anwendung von P. pulmonarius beim Abbau von Phorbolestern und der damit einhergehenden Anreicherung von Lignozelluloserückständen3 bestand das Ziel dieser Studie darin, Referenzgene zur Normalisierung der Genexpressionsdaten für P. pulmonarius zu identifizieren, das auf Jatropha-Kuchen in Gegenwart und Abwesenheit von kultiviert wurde das giftige Diterpen Phorbolester.

Mehrere potenzielle Referenzgene wurden für das Screening in P. pulmonarius während des Wachstums auf toxischem und nicht-toxischem Jatropha-Kuchen ausgewählt. Diese kodierten Proteine, die an konstitutiven Pilzaktivitäten beteiligt sind, wie β-Tubulin und Actin 1, die beide an der strukturellen Aktivität beteiligt sind, GAPDH, das an der Glykolyse beteiligt ist, und PHOS, das eine wichtige Rolle bei der Synthese von Aminosäuren und stickstoffhaltigen Basen spielt , EF1α, beteiligt an Translationsprozessen, und TRPHO, beteiligt am Membranschutz19,38,39,40.

Die mathematischen Algorithmen von geNorm28, NormFinder29 und BestKeeper41 wurden häufig für die Entwicklung von Referenzgenen in verschiedenen Königreichen eingesetzt, wobei kombinierte Daten im Allgemeinen eine genaue Identifizierung stabiler normalisierender Gene ermöglichen. Hier zeigten die mit NormFinder und geNorm erhaltenen Daten eine Überlappung für die stabilsten und die am wenigsten stabilen Gene, im Gegensatz zu den mit BestKeeper erhaltenen Ergebnissen. Diskrepanzen in den mit der unterschiedlichen Software erzielten Ergebnissen sind häufig19. BestKeeper ist ein Algorithmus, der für In-vivo-Proben möglicherweise unzureichend ist, da das verwendete Berechnungsmodell (geometrisches Mittel der Referenzgene mit einer Standardabweichung > 1) nicht zu Variationen biologischer Systeme passt und auf kontrollierte Bedingungen beschränkt ist23,42.

Basierend auf den mit geNorm und NormFinder erzielten Ergebnissen wurde die höchste Stabilität unter den bewerteten Housekeeping-Genen bei den Genen PHOS und EF1α beobachtet. Laut Castanera und Mitarbeitern19 zeigte das PHOS-Gen ebenfalls eine hohe Stabilität und eignet sich zur Normalisierung der Genexpression in P. ostreatus unter Verwendung derselben Algorithmen. Das EF1α-Gen wurde kürzlich als sekundäre Barcode-Region zur molekularen Identifizierung von Pilzen auf Artenebene43, einschließlich Basidiomyceten der Gattung Pleurotus44,45, eingeführt. Daher entspricht dieses Gen auch den Richtlinien für ideale Referenzgene, mit Konservierung in der Ziel-DNA-Sequenz, Speziesspezifität, konstanter Kopienzahl und ohne allelische Variation36. Zuvor wurde berichtet, dass das GAPDH-Gen gemäß den mit dem geNorm-Algorithmus generierten Daten für die Normalisierung der Expression im Basidiomyceten P. tuber-regium ungeeignet sei37. Hier zeigte sich auch, dass das GAPDH-Gen ebenso wie das ACTIN-Gen für die Normalisierung der Genexpression in auf Jatropha-Kuchen kultivierten P. pulmonarius ungeeignet ist. Castanera und Kollegen19 berichteten, dass die konstitutiven Gene ACTIN, GAPDH1 und β-TUB gemäß den mit Genorm und NormFinder generierten Ergebnissen am wenigsten stabil für die Normalisierung der Genexpression in P. ostreatus waren, die auf lignozellulosehaltigen Rückständen kultiviert wurden. Offensichtlich kann die Verwendung konstitutiver Gene als Referenzgene ohne Validierung ihrer Stabilität zu Fehlern in der Genexpressionsanalyse führen37,46. Angesichts der früheren Berichte über die drei Pleurotus-Arten scheint das konstitutive Gen GAPDH nicht geeignet zu sein, die Expression von Genen in Basidiomyceten der Gattung Pleurotus zu normalisieren.

Pleurotus pulmonarius gehört zur Klasse der saprotrophen Basidiomyceten, Pilze, die die Fähigkeit entwickelt haben, die komplexen Polymere abzubauen, aus denen pflanzliche Zellwände bestehen47,48. Innerhalb der Basidiomyceten wird P. pulmonarius als Weißfäulepilz klassifiziert, der Lignin durch die Wirkung oxidativer Enzyme vollständig abbauen kann48,49,50,51. Laccase (LAC), Manganperoxidase (MnP), Ligninperoxidase (LiP) und vielseitige Peroxidase (VP) sind wichtige Enzyme beim Ligninabbau und es wird angenommen, dass sie die ersten in der Reihe der Proteine ​​sind, die während des Ligninabbaus durch Pilze exprimiert werden49. Es wurde berichtet, dass Mitglieder der Gattung Pleurotus Gene besitzen, die für MNP und VP kodieren, nicht jedoch Gene, die für LiP kodieren52. Angesichts der Bedeutung oxidativer Enzyme für saprotrophe Basidiomyceten wurden hier auch Gene, die für LAC-, MnP- und VP-Proteine ​​kodieren, auf Genstabilität getestet. Es gibt kaum Literatur zur Auswahl von Referenzgenen für P. pulmonarius, obwohl das MYP-Gen für die QPCR-Quantifizierung von P. pulmonarius-Myzelien beschrieben wurde53. In unseren Ergebnissen zeigte das MYP-Gen nur unter toxischen Kulturbedingungen Stabilität. Darüber hinaus zeigte dieses Gen sowohl unter toxischen als auch unter nichttoxischen Bedingungen den höchsten Cq-Wert, was darauf hindeutet, dass es unter diesen Bedingungen möglicherweise weniger exprimiert wird. Die LAC- und VP-Gene zeigten unter keiner der getesteten Bedingungen Stabilität, wobei Boxplot-Daten auf Ausreißer innerhalb der Analysen hindeuteten. Im Gegensatz zu den anderen Genen, die für oxidative Enzyme kodieren, zeigte das MNP3-Gen, das eine andere Manganperoxidase als das MYP-Gen kodiert, unter den experimentellen Bedingungen eine hohe Stabilität, ebenso wie die Gene PHOS und EF1α.

Laut Phengnuam und Suntornsuk54 sowie Nakao et al.55 sind Esterasen die primären Enzyme, die am Abbau von Phorbolestern durch Bakterien der Gattung Bacillus beteiligt sind. Basierend auf internen RNA-seq-Daten für P. pulmonarius auf toxischem und ungiftigem Jatropha-Kuchen (unveröffentlicht) kodiert das CHU_2040-Gen eine Esterase, die möglicherweise am vollständigen Abbau von Phorbolestern beteiligt ist. Durch Vergleich mit RNA-seq-Daten wurde die relative Expression dieses Gens verwendet, um die Stabilität der Referenzgene zu validieren. Wenn die am höchsten eingestuften stabilen Genkombinationen (PHOS-EF1α und EF1α-MNP3) zur Normalisierung der relativen Expression des CHU_2040-Gens verwendet wurden, stimmten die Ergebnisse der differentiellen Expression mit den In-silico-Daten überein. Im Gegensatz dazu zeigte das Expressionsmuster von CHU_2040 bei Verwendung der am wenigsten stabilen Referenzgene für die Normalisierung, nämlich LAC und VP, ein deutliches Profil, das erheblich von den In-silico-Expressionsdaten abwich, was ihre Ungeeignetheit als Normalisierungsgene unter den verwendeten spezifischen Wachstumsbedingungen verdeutlichte für P. pulmonarius. Diese Ergebnisse zeigten deutlich, dass unterschiedliche Referenzgene die relative Expression von Zielgenen unter bestimmten Wachstumsbedingungen beeinflussen können.

Zusammenfassend identifizierte diese erste Untersuchung zur Entwicklung von Referenzgenen für P. pulmonarius drei stabile Gene, die zur Normalisierung der Genexpression während der Kultur auf Jatropha-Kuchen mit oder ohne die toxische Verbindung Phorbolester geeignet sind. Darüber hinaus zeigten gepaarte Variationsanalysen, dass eine Gennormalisierung mit zwei Referenzgenen durchgeführt werden kann. Während P. pulmonarius in der Biotechnologie eine erhebliche Bedeutung hat, sind die Daten zur molekularen Untersuchung dieses Pilzes noch relativ begrenzt. Zusammen mit dem aktuellen Referenzgenom für P. pulmonarius16 eignet sich der hier entwickelte Satz von Referenzgenen zur Normalisierung der Genexpression für zukünftige transkriptomische Analysen und die Validierung der Genexpression dieses Pilzes auf diesem lignozellulosehaltigen Rest.

Kuchen wurden durch mechanisches Pressen von Samen für genetische Akzessionen von ungiftigem (Zugang 169) und giftigem J. curcas (Zugang 123) gewonnen, die alle von der Keimplasmabank bei Embrapa Agroenergia bereitgestellt wurden. Vor dem Pressen wurden die Samen einzeln zwei Stunden lang mit einem Rotationsmischertrockner (SCOLT TECH, ERT 60 II) auf 60 °C erhitzt. Die gepressten Samen wurden dann mit einem Öl- und Fettextraktor (SCOLT TECH, SMR 610-6) verarbeitet, um sowohl Rohöl als auch die in dieser Studie verwendeten Kuchen zu erhalten. Die methanolische Extraktion von Phorbolestern und die Quantifizierung mittels HPLC wurden nach der von Gomes et al.3 beschriebenen Methode durchgeführt. Die Konzentration an Phorbolestern im toxischen Kuchen wurde mit 2,17 mg/g gemessen, während der ungiftige Kuchen mit der verwendeten Technik keine nachweisbaren Mengen an Phorbolestern enthielt.

Der Pleurotus pulmonarius-Stamm BRM 055674, der aus der Basidiomyceten-Sammlung bei Embrapa Agroenergia stammt, wurde nach der Castellani-Methode56 konserviert. Anschließend wurden die Myzelscheiben auf Jatropha-Agar-Kulturmedium3 übertragen und 7 Tage lang bei 28 °C inkubiert. Wie oben beschrieben, wurden verfügbare, natürlich ungiftige Sorten von J. curcas57, die keine Phorbolester synthetisieren oder nur minimale Mengen an Phorbolestern aufweisen, in Bioassays als Kontrollen für die Analyse der Genexpressionsmodulation nach Pilzwachstum auf toxischem Jatropha-Kuchen eingesetzt. Für die Festkörperkultivierung wurden 100 g jedes Substrats aus toxischem und ungiftigem Jatropha-Kuchen auf 70 % Luftfeuchtigkeit angefeuchtet und in Petrischalen von 150 mm × 20 mm überführt. Nach der Sterilisation wurden 7 Tage alte P. pulmonarius-Myzelpfropfen entweder auf toxischen Jatropha-Kuchen (Behandlung T) oder auf ungiftigen Jatropha-Kuchen (Behandlung NT) geimpft und dann bei 28 °C inkubiert. Pilzmyzelien, die die Substrate besiedelten, wurden zu drei Zeitpunkten über einen Inkubationszeitraum von 3, 7 und 11 Tagen gesammelt. Alle Bioassays wurden dreifach durchgeführt. Wie oben beschrieben, entsprach der dritte analysierte Zustand einer Kombination aus T- und NT-Behandlungsdatensätzen und wird durchgehend als kombinierter Zustand bezeichnet (Behandlung C).

Myzelproben von P. pulmonarius wurden für beide Behandlungen 3, 7 und 11 Tage nach der Inokulation (DAI) von der Oberfläche des kolonisierten Jatropha-Kuchens gesammelt. Myzel wurde sofort in flüssigem Stickstoff schockgefroren und dann bei –80 °C gelagert. Die Extraktion und Reinigung der Gesamt-RNA für jede Behandlung wurde unter Verwendung eines INVITRAP® SPIN PLANT RNA-Kits (Stratec Molecular GMBH, Berlin, Deutschland) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Die Gesamt-RNA wurde mit DNase I (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) behandelt, um restliche genomische DNA zu entfernen. Die Gesamt-RNA-Konzentration und -Integrität wurden mittels 1 % Agarosegelelektrophorese und Nanodrop ND-1000-Spektrophotometrie (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) analysiert. Zur Synthese von cDNA wurden aus biologischen Dreifachproben für jede Versuchsbedingung (3DAI_NT, 3DAI_T, 7DAI_NT, 7DAI_T, 11DAI_NT, 11DAI_T) insgesamt 1 μg Gesamt-RNA unter Verwendung von Super Script II RT- und Oligo(dT)-Primern revers in cDNA transkribiert (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA).

Um potenzielle Referenzgene mit stabiler Expression in P. pulmonarius auszuwählen, der auf Jatropha-Kuchenabfällen gezüchtet wurde, wurden Kandidatengene für das Screening ausgewählt, die Proteine ​​kodieren, die wahrscheinlich an Basalzellaktivitäten verschiedener Arten der Gattung Pleurotus beteiligt sind (Ergänzungstabelle S1). Die Software PrimerQuest Tool (Integrated DNA Technologies – IDT, Iowa, EUA) wurde für den Entwurf spezifischer Primer für jedes Kandidaten-Referenzgen verwendet. Die erwarteten Zielamplikons variierten zwischen 90 und 120 bp, wobei jedes Primerpaar auf vorhergesagte Exon-Exon-Übergänge ausgelegt war, um eine Amplifikation aus genomischer DNA zu vermeiden und eine Amplifikation aus cDNA sicherzustellen. Die Spezifität der Primerpaare wurde zunächst durch In-silico-PCR anhand einer lokalen Datenbank mit RNAseq-Daten für P. pulmonarius getestet. Anschließend wurden die Primerspezifität und -effizienz anhand der cDNA getestet, die aus den biologischen Triplikaten jeder Versuchsbedingung für P. pulmonarius stammte, das auf toxischem und nichttoxischem Jatropha-Kuchen kultiviert wurde.

Für die RT-qPCR-Analyse der Expression potenzieller Referenzgene wurde ein Platinum SYBR Green qPCR Super Mix-UDG mit ROX-Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) verwendet. PCR-Amplifikationen wurden mit einem ABI StepOne® Real-Time PCR-Thermocycler (Applied Biosystems, Foster City, USA) durchgeführt. Die PCR-Amplifikation wurde an drei experimentellen Replikaten und drei technischen Replikaten pro Behandlung durchgeführt. Jede PCR-Reaktion umfasste 2 μl einer 1:20-Verdünnung der Template-cDNA, 0,2 μM jedes Primers und 5 μl Platinum® SYBR® Green qPCR Super Mix-UDG mit ROX-Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) zu a Endvolumen von 10 μL. Der PCR-Thermozyklus umfasste 2 Minuten bei 52 °C, 10 Minuten bei 95 °C, gefolgt von 40 Denaturierungszyklen bei 95 °C für 15 Sekunden, gefolgt von Primer-Annealing und Extension bei 62 °C für 60 Sekunden. Die Analyse der Tm (Dissoziation) von Amplifikaten wurde mit der Software SDS 2.2.2 (Applied Biosystems, Foster City, USA) durchgeführt, um die Spezifität der Primer zu überprüfen. Rohe ΔRn-Daten wurden verwendet, um die RT-qPCR-Effizienz für jedes Gen mithilfe des Programms LinRegPCR, Version 2017.1 (https://www.gear-genomics.com/rdml-tools/) zu bestimmen.

Die Stabilitätsanalyse und die Validierung der Expression für jedes Kandidaten-Referenzgen basierten auf Quantifizierungszyklus-Werten (Cq) für jede cDNA-Probe. Dieser Wert gibt die Gesamtzahl der Amplifikationszyklen während der exponentiellen PCR-Amplifikationsphase an, die erforderlich sind, um einen Standardschwellenwert für die Amplifikationserkennung zu erreichen. Die Expressionsstabilität jedes Gens wurde mithilfe der Analysealgorithmen geNorm28, NormFinder29 und BestKeeper41 bestimmt. GeNorm wurde auch verwendet, um die Expressionsstabilität auf der Grundlage eines durchschnittlichen M-Werts zu berechnen, der die paarweise Variation eines bestimmten Gens gegenüber allen anderen Genen darstellt. Die größte Expressionsstabilität wird durch die niedrigsten M-Werte repräsentiert, wobei die stabilsten Gene M-Werte unter einem Schwellenwert von 0,5 aufweisen. GeNorm berechnet außerdem den paarweisen Variations-V-Wert (Vn/n + 1) zwischen jedem potenziellen Referenzgen, um die optimale Anzahl von Referenzgenen für den Einsatz bei der Genexpressionsnormalisierung zu bestimmen. Anschließend wurde die Software qbase+ (CellCarta, Montreal, Quebec) zur Berechnung der durchschnittlichen Quantifizierungszyklen (Cqs) pro Gen und die Software GraphPad Prism v7 (Dotmatics, Boston, EUA) zur statistischen Analyse verwendet.

Kombinationen der stabilsten Gene (PHOS und EF1α; MNP3 und EF1α) und der am wenigsten stabilen Referenzgene (LAC und VP) wurden zur Normalisierung der relativen Expression des CHU_2040-Gens verglichen, das für ein Esteraseenzym kodiert, das möglicherweise an Phorbolester beteiligt ist Degradierung. RNA-Extraktion, cDNA-Synthese und qPCR wurden alle wie zuvor beschrieben durchgeführt. Zur Berechnung der durchschnittlichen Quantifizierungszyklen (Cqs) pro Gen wurde die Software qbase+ (Biogazelle) eingesetzt, für die statistische Analyse des kombinierten Zustands die Software GraphPad Prism v7.

Alle während der Studie generierten und analysierten Daten sind im veröffentlichten Artikel und seinen Zusatzinformationsdateien enthalten.

Giwa, A. et al. Technoökonomische Bewertung der Nachhaltigkeit einer integrierten Bioraffinerie aus Mikroalgen und Jatropha: Eine Überprüfung und Fallstudie. Erneuern. Aufrechterhalten. Energy Rev. 88, 239–257 (2018).

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Diese Arbeit wurde von den brasilianischen Förderorganisationen FAPDF (Grant 193.001195/2016), CNPq/Embrapa (Grant 404786/2013-8) und CAPES (Grants Capes-Embrapa 15/2014 und CAPES Finance Code 001) finanziert. RNGM wurde durch ein Stipendium von CNPq (Grant 308165/2021-7) unterstützt.

Diese Autoren trugen gleichermaßen bei: Taísa Godoy Gomes und Fernando Campos de Assis Fonseca.

Abteilung für Zellbiologie, Institut für Biowissenschaften, Universität Brasília, Campus der Universität Darcy Ribeiro, Brasília, DF, 70910-900, Brasilien

Taísa Godoy Gomes, Fernando Campos de Assis Fonseca, Gabriel Sergio Costa Alves und Robert Neil Gerard Miller

Federal Institute of Goiás (IFG), Águas Lindas, GO, 72910-733, Brasilien

Fernando Campos de Assis Fonseca

Embrapa Agroenergia, STN-70297-400, Brasília, DF, 70297-400, Brasilien

Félix Gonçalves de Siqueira

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RNGM, FCAF, GSCA und FGS haben die Studie konzipiert und gestaltet. TGG führte die Bioassays und die RT-qPCR-Analyse durch. FCAF führte eine RT-qPCR-Analyse durch. TGG, FCAF, GSCA, FGS und RNGM analysierten die Daten, lieferten intellektuellen Input, verfassten und überarbeiteten das Manuskript. Alle Autoren haben das endgültige Manuskript gelesen und genehmigt.

Korrespondenz mit Robert Neil Gerard Miller.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Gomes, TG, de Assis Fonseca, FC, Alves, GSC et al. Entwicklung von Referenzgenen für die RT-qPCR-Analyse der Genexpression in Pleurotus pulmonarius für biotechnologische Anwendungen. Sci Rep 13, 12296 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-39115-4

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Eingegangen: 25. April 2023

Angenommen: 20. Juli 2023

Veröffentlicht: 29. Juli 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-39115-4

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